Przełom w leczeniu białaczki – liposomy z kwasem glikocholowym

Czy nowatorskie liposomy mogą zrewolucjonizować leczenie ALL?

Przełom w dostarczaniu metotreksatu do ośrodkowego układu nerwowego może zrewolucjonizować leczenie ostrej białaczki limfoblastycznej. Naukowcy opracowali innowacyjny system liposomów zawierających kwas glikocholowy, który znacząco zwiększa przenikanie leku przez barierę krew-mózg.

Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) to nowotwór hematologiczny dotykający zarówno dzieci, jak i dorosłych. Powstaje w wyniku niekontrolowanej proliferacji i nieprawidłowego różnicowania komórek progenitorowych układu limfoidalnego w szpiku kostnym. Obecność komórek białaczkowych w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) istotnie zwiększa ryzyko powikłań i śmiertelności. Dotychczasowe metody zapobiegania zajęciu OUN obejmują radioterapię, chemioterapię systemową oraz dokanałowe podawanie leków.

Tradycyjne podejścia terapeutyczne niosą ze sobą znaczące wyzwania. Radioterapia czaszki wywołuje poważne działania niepożądane, takie jak endokrynopatia i neurotoksyczność, co doprowadziło do zastępowania jej terapią systemową i dokanałową. W terapii systemowej stosowano wysokie dawki metotreksatu (5-8 g/m²), jednak ich wykorzystanie jest ograniczone ze względu na ogólnoustrojową toksyczność i trudności w utrzymaniu odpowiedniego stężenia leku w płynie mózgowo-rdzeniowym. Z kolei dokanałowe podawanie metotreksatu, choć szeroko stosowane, wiąże się z takimi działaniami niepożądanymi jak ból pleców, ból głowy i parestezje. Ponadto wymaga ono zaangażowania specjalistów, takich jak onkolodzy czy hematolodzy.

“Potrzebny jest system dostarczania leków, który dostarczyłby wystarczającą ilość terapeutyczną metotreksatu do OUN poprzez podanie dożylne, które jest wygodniejsze niż droga dokanałowa” – piszą autorzy badania.

Jak przełamać barierę krew-mózg przy użyciu liposomów?

Główną przeszkodą w skutecznym dostarczaniu metotreksatu do OUN jest bariera krew-mózg. Jest to złożona struktura naczyń mikrokrwionośnych mózgu, składająca się z komórek śródbłonka mózgowego, które są połączone ścisłymi połączeniami i otoczone oddzielnie przez astrocyty, perycyty, mikroglej i neurony. Ze względu na półprzepuszczalną naturę tej bariery, cząsteczki lipofilowe mogą przenikać do OUN łatwiej niż cząsteczki hydrofilowe. Metotreksat, ze swoją masą cząsteczkową 454,56 g/mol i współczynnikiem podziału (log P) wynoszącym -1,85, charakteryzuje się słabą przenikalnością przez tę barierę. Czy możliwe jest pokonanie tej przeszkody bez uciekania się do inwazyjnych metod podania?

Metotreksat jest cytostatycznym lekiem antymetabolitowym, który hamuje reduktazę dihydrofolianową. Jest stosowany w chemioterapii i leczeniu chorób autoimmunologicznych. Z powodu niskiej wartości log P, metotreksat wykazuje słabą przenikalność przez barierę krew-mózg.

Liposomy, sferyczne nanocząsteczki zbudowane głównie z fosfolipidów i cholesterolu, mogą być rozwiązaniem tego problemu. Zawierają one mono- lub wielowarstwowe błony lipidowe, które mogą zamykać zarówno cząsteczki hydrofilowe, jak i lipofilowe. Wcześniejsze badania wykazały skuteczność liposomów w dostarczaniu leków przeciwnowotworowych, takich jak irynotekan, topotekan i paklitaksel, przez barierę krew-mózg.

Innowacyjnym podejściem w tym badaniu było wykorzystanie kwasów żółciowych – naturalnych biologicznych surfaktantów syntetyzowanych z cholesterolu w wątrobie. Kwasy żółciowe sprzężone z aminokwasami, mianowicie glicyną i tauryną, tworzą odpowiednio kwas glikocholowy i kwas taurocholowy. Sprzężone kwasy żółciowe są magazynowane w pęcherzyku żółciowym i wydzielane do jelita w celu emulgowania lipidów do wchłaniania. Ze względu na swoją biokompatybilność, sprzężone kwasy żółciowe są wykorzystywane w preparatach farmaceutycznych. Na przykład, kwas glikocholowy stosuje się do solubilizacji witaminy K do wstrzyknięć dożylnych (Konakion®MM).

Badacze przygotowali liposomy zawierające metotreksat z dodatkiem kwasu glikocholowego lub taurocholowego w różnych stężeniach (0,5%, 1%, 2%) i ocenili ich zdolność do zwiększania przenikania metotreksatu przez barierę krew-mózg, wykorzystując model in vitro tej bariery. Zbadano również wpływ rozmiaru liposomów na zdolność przenikania przez barierę krew-mózg oraz szlaki transportu liposomów z kwasami żółciowymi przez tę barierę.

Do przygotowania liposomów wykorzystano metodę cienkiego filmu. Fosfolipidy i cholesterol rozpuszczano w mieszaninie chloroformu i metanolu, a następnie odparowywano rozpuszczalnik, tworząc cienki film lipidowy. Film ten uwadniano roztworem metotreksatu w buforze fosforanowym o pH 8. W przypadku liposomów zawierających kwasy żółciowe, kwas glikocholowy lub taurocholowy dodawano do roztworu uwadniającego. Rozmiar otrzymanych liposomów zmniejszano za pomocą sonikacji, a następnie odwirowywano w celu zebrania supernatantu.

Charakterystyka fizykochemiczna liposomów obejmowała pomiar średniego rozmiaru cząstek, wskaźnika polidyspersji (PDI) i potencjału zeta. Badano również efektywność zamknięcia (% EE) metotreksatu w liposomach. Wyniki wykazały, że dodanie 0,5% kwasu glikocholowego lub taurocholowego zwiększało rozmiar cząstek liposomów, podczas gdy dodanie 1% i 2% tych kwasów zmniejszało rozmiar cząstek. Przy stężeniach 0,5% i 1%, dodanie kwasu glikocholowego zmniejszało rozmiar cząstek liposomów bardziej niż dodanie kwasu taurocholowego.

Badając efektywność zamknięcia metotreksatu w liposomach, naukowcy odkryli, że zwiększenie ilości metotreksatu do 20% masy lipidów prowadziło do wzrostu % EE, osiągając najwyższą wartość 41,14 ± 1,83. Jednak gdy ilość metotreksatu wzrosła powyżej 20%, % EE stopniowo malał. Dlatego do dalszych badań wybrano 20% metotreksatu w stosunku do masy lipidów (0,17% w/v formulacji liposomowej).

Do badania transportu in vitro przez model bariery krew-mózg wykorzystano monokulturę ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyń mózgowych (HBEC-5i). Komórki wysiewano na wkładki Transwell® z membraną PET o wielkości porów 3 µm i powierzchni wzrostu 1,12 cm². Integralność bariery oceniano poprzez pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER).

Wyniki badania wykazały, że liposomy z dodatkiem kwasu glikocholowego mogą zwiększyć przenikanie metotreksatu przez barierę krew-mózg, podczas gdy kwas taurocholowy nie wykazał takiego efektu. Optymalne stężenie kwasu glikocholowego dodanego do liposomów, które mogło zwiększyć przenikanie metotreksatu przez barierę krew-mózg, wynosiło 1%. Liposomy z 1% kwasu glikocholowego miały średni rozmiar cząstek 30,21 nm, co jest znacznie mniejsze niż liposomy z 0,5% kwasu glikocholowego (120,73 nm). Mniejszy rozmiar cząstek umożliwił lepsze przenikanie przez barierę krew-mózg.

Kinetyka przenikania i szybkość przenikania roztworu metotreksatu jako kontroli i każdej formulacji liposomów zawierających metotreksat najlepiej pasowały do modelu kinetycznego Higushiego. Liposomy z 1% kwasu glikocholowego (L1%G) miały znacząco większą szybkość przenikania niż roztwór, konwencjonalne liposomy (CL), liposomy z 0,5% kwasu glikocholowego (L0,5%G), liposomy z 0,5% kwasu taurocholowego (L0,5%T), liposomy z 1% kwasu taurocholowego (L1%T) i liposomy z 2% kwasu taurocholowego (L2%T). Nie było istotnej różnicy między L1%G a liposomami z 2% kwasu glikocholowego (L2%G).

Czy ta innowacja zmieni praktykę kliniczną?

Jak działają te innowacyjne liposomy? Badanie szlaków transportu wykazało, że liposomy z 1% kwasu glikocholowego przenikają przez barierę krew-mózg głównie drogą transkomórkową, przez bezpośrednią penetrację do komórek, a nie przez szlaki endocytotyczne, jak początkowo przypuszczano. Wartości TEER przed i po leczeniu liposomami zawierającymi 1% kwasu glikocholowego nie różniły się istotnie, co sugeruje, że transport liposomów przez drogę parakomórkową może być mniejszościowym szlakiem.

Do badania dróg transportu liposomów przez barierę krew-mózg wykorzystano cztery specyficzne inhibitory endocytozy: chlorpromazynę (inhibitor endocytozy zależnej od klatryny), genistein i filipinę (inhibitory endocytozy zależnej od kaweoli) oraz amilorid (inhibitor makropinocytozy). Liposomy znakowano czerwoną fluorescencją za pomocą rodaminy DHPE.

Wyniki cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej wykazały, że liposomy z 1% kwasu glikocholowego były widoczne wewnątrz komórek, mimo zastosowania inhibitorów endocytozy. Sugeruje to, że pobieranie tego typu liposomów nie obejmowało pinocytozy. Fagocytoza również nie była zaangażowana w proces pobierania tych liposomów, ponieważ jest to mechanizm charakterystyczny dla cząstek większych niż 500 nm, podczas gdy średni rozmiar liposomów z 1% kwasu glikocholowego wynosił 30,21 nm. Dlatego też, głównym szlakiem transportu liposomów z 1% kwasu glikocholowego przez barierę krew-mózg była bezpośrednia penetracja do komórek.

Jakie znaczenie mają te odkrycia dla praktyki klinicznej? Liposomy z 1% kwasu glikocholowego mogą stanowić obiecującą alternatywę dla inwazyjnego podawania dokanałowego metotreksatu. Dożylne podanie takiej formulacji mogłoby zapewnić wystarczającą ilość leku w OUN bez konieczności uciekania się do bardziej inwazyjnych metod. Czy ta innowacyjna metoda mogłaby zmniejszyć potrzebę stosowania radioterapii i zmniejszyć ogólnoustrojową toksyczność związaną z wysokimi dawkami metotreksatu?

“Liposomy z 1% kwasu glikocholowego okazały się obiecującymi kandydatami do dalszych badań in vivo” – konkludują autorzy badania.

To przełomowe badanie otwiera nowe możliwości w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej, szczególnie w zapobieganiu zajęciu OUN. Dalsze badania in vivo są niezbędne, aby potwierdzić skuteczność i bezpieczeństwo tej metody dostarczania metotreksatu, ale już teraz wyniki sugerują, że może ona znacząco poprawić jakość życia pacjentów z ALL, zmniejszając potrzebę inwazyjnych procedur i ograniczając działania niepożądane związane z obecnymi metodami leczenia.

Podsumowanie

Badanie przedstawia innowacyjną metodę dostarczania metotreksatu do ośrodkowego układu nerwowego w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL). Kluczowe odkrycia to:
\- Opracowanie liposomów zawierających 1% kwasu glikocholowego, które znacząco zwiększają przenikanie metotreksatu przez barierę krew-mózg
\- Optymalny rozmiar liposomów wynosi 30,21 nm
\- Transport odbywa się głównie drogą transkomórkową poprzez bezpośrednią penetrację
\- Metoda może wyeliminować konieczność inwazyjnego podawania dokanałowego leku
\- Wykazano wysoką efektywność zamknięcia metotreksatu w liposomach (41,14%)
System może stanowić przełom w leczeniu ALL, oferując mniej inwazyjną i bardziej skuteczną metodę terapii.

Bibliografia

Charernsriwilaiwat Natthan, Thaitrong Rattanan, Plianwong Samarwadee, Opanasopit Praneet, Songprakhon Pucharee and Subongkot Thirapit. Development and Transportation Pathway Evaluation of Liposomes with Bile Acids for Enhancing the Blood-Brain Barrier Penetration of Methotrexate. Pharmaceutics 2025, 17(2), e577-245. DOI: https://doi.org/10.3390/pharmaceutics17020269.