Niosomowy system z MTX i SiL przełamuje bariery w leczeniu TNBC

Czy niosomowy system może przełamać bariery leczenia TNBC?

Badanie eksperymentalne przeprowadzone przez zespół badaczy koncentrowało się na ocenie skuteczności niosomalnego systemu dostarczania leków zawierającego metotreksat (MTX) i silibininę (SiL) w leczeniu potrójnie negatywnego raka piersi (TNBC). Naukowcy zastosowali model mammosfer, czyli trójwymiarowych struktur komórkowych wzbogaconych w komórki macierzyste raka, które lepiej odzwierciedlają mikrośrodowisko guza niż tradycyjne modele dwuwymiarowe.

Badanie przeprowadzono na komórkach linii MDA-MB-231 pochodzących z potrójnie negatywnego raka piersi, które hodowano zarówno w systemie 2D, jak i 3D (mammosfery). Populacja badana obejmowała komórki raka piersi MDA-MB-231, które charakteryzują się wysoką agresywnością, potencjałem przerzutowym oraz opornością na standardowe metody leczenia. Wybór tej linii komórkowej był podyktowany jej reprezentatywnością dla TNBC – podtypu raka piersi, który stanowi szczególne wyzwanie terapeutyczne ze względu na brak receptorów estrogenowych, progesteronowych i HER2, co ogranicza możliwości terapii celowanej.

Naukowcy skupili się na ocenie skuteczności kombinacji MTX – folianowego analogu hamującego syntezę DNA, stosowanego w terapii różnych nowotworów, w tym raka piersi, oraz SiL – naturalnego lignanu o szerokim spektrum działania przeciwnowotworowego. Oba te związki zostały załadowane do niosomów – nanonośników zbudowanych z niejonowych surfaktantów tworzących dwuwarstwowe pęcherzyki. Wybór niosomów jako systemu dostarczania leków był podyktowany ich unikalnymi właściwościami: możliwością jednoczesnego przenoszenia leków hydrofilowych i hydrofobowych, niższą cytotoksycznością w porównaniu do innych nanocząstek, łatwością syntezy oraz efektywnością kosztową.

Jak przygotowano niosomalne nanocząstki i jakie mają właściwości?

Niosomy zawierające MTX i SiL (NiO@MTXSiL) zostały przygotowane metodą hydratacji cienkiego filmu (TFH). Do syntezy wykorzystano Span 60 (10 mg), Tween 80 (18 mg), cholesterol (7 mg) i SiL (2 mg), które rozpuszczono w mieszaninie metanolu i chloroformu. Po odparowaniu rozpuszczalników powstały proliposom uwodniono roztworem PBS zawierającym MTX (2 mg). Charakterystyka fizykochemiczna wykazała, że otrzymane nanocząstki miały średnicę 87,54 ± 20,55 nm według analizy DLS, a obrazowanie TEM potwierdziło ich sferyczną morfologię o rozmiarze około 60 nm. Potencjał zeta wynosił -15 ± 8 mV, co wskazuje na stabilność fizyczną niosomów. Efektywność enkapsulacji wynosiła 88,5 ± 3% dla SiL i 81 ± 15% dla MTX.

Badania uwalniania leków wykazały, że w środowisku kwaśnym (pH 5,8) charakterystycznym dla mikrośrodowiska guza, uwalnianie obu leków było znacząco wyższe (88,62% dla MTX i 86,64% dla SiL) w porównaniu do środowiska o pH fizjologicznym 7,4 (65,62% dla MTX i 65,84% dla SiL) w ciągu 72 godzin. Analiza kinetyki uwalniania leków wykazała, że model Higuchiego najlepiej opisywał uwalnianie SiL (R² = 0,946 przy pH 7,4 i R² = 0,941 przy pH 5,8), podczas gdy dla MTX zarówno model Higuchiego, jak i Korsmeyera-Peppasa wykazywały porównywalnie dobre dopasowanie. Silna korelacja z modelem Higuchiego sugeruje, że główny mechanizm uwalniania leków opiera się na kinetyce dyfuzji.

Jakie efekty przeciwnowotworowe wykazuje NiO@MTXSiL w testach in vitro?

Wyniki badań cytotoksyczności na komórkach MDA-MB-231 wykazały, że NiO@MTXSiL powodował większą toksyczność w porównaniu do wolnych leków i pojedynczych niosomalnych formulacji we wszystkich testowanych stężeniach. Przy najwyższej dawce 10 μg/ml, NiO@MTXSiL zmniejszył żywotność komórek do 21,4% w porównaniu do MTXSiL (32,86%), MTX (49,88%), SiL (58,2%), NiO@MTX (39,7%) i NiO@SiL (45,3%). Co istotne, we wszystkich badanych stężeniach żywotność komórek w grupach traktowanych pustymi niosomami wynosiła >85%, co wskazuje na bezpieczeństwo i biokompatybilność przygotowanych nośników.

Analiza indeksu kombinacji (CI) potwierdziła silny synergizm między dwoma lekami, przy czym formulacje niosomalne wykazywały niższą wartość CI (0,431 μg/ml) niż wolne leki (0,54 μg/ml), co wskazuje na lepszy efekt synergistyczny. Dodatkowo, indeks redukcji dawki (DRI) wynosił 3,13 μg/ml i 4,45 μg/ml dla MTX i SiL oraz 3,63 μg/ml i 6,38 μg/ml dla NiO@MTX i NiO@SiL, co potwierdza możliwość zmniejszenia dawki przy zachowaniu skuteczności terapeutycznej.

Ocena odpowiedzi przeciwnowotworowej NiO@MTXSiL w mikroguzach TNBC wykazała znaczną redukcję wielkości sferoidów w ciągu 72 godzin. Średnica sferoidów w nieleczonej grupie kontrolnej pozostała niezmieniona (~300-400 μm), podczas gdy w grupie leczonej NiO@MTXSiL5 zaobserwowano niemal całkowitą eliminację mikroguzów TNBC po 72 godzinach, z redukcją wielkości do 104,51 ± 13,25 μm po 24h, 67,01 ± 7,9 μm po 48h i zaledwie 6,07 ± 1,5 μm po 72h.

Barwienie Annexin V-FITC/PI ujawniło dawkozależną indukcję apoptozy. W nieleczonej grupie kontrolnej prawie wszystkie komórki pozostały żywe, podczas gdy w grupach traktowanych różnymi dawkami NiO@MTXSiL zaobserwowano dawkozależną toksyczność. Przy NiO@MTXSiL2 nastąpiła częściowa indukcja apoptozy (~50%), podczas gdy przy NiO@MTXSiL5 i NiO@MTXSiL10 zaobserwowano całkowitą odpowiedź przeciwnowotworową i niemal pełną indukcję apoptozy (~100% martwych komórek).

Dodatkowo, barwienie F-aktyny/DAPI wykazało znaczącą redukcję gęstości adhezji komórkowej (o 42,528%) w komórkach MDA-MB-231 traktowanych NiO@MTXSiL5 po 24 godzinach, podczas gdy w grupie traktowanej pustymi niosomami (20 μg/ml) nie zaobserwowano istotnych zmian w gęstości adhezji komórkowej w porównaniu do nieleczonej grupy. Ta redukcja adhezji komórkowej sugeruje potencjalne właściwości przeciwprzerzutowe formulacji.

Jakie ścieżki molekularne ujawnia analiza interakcji MTX i SiL?

Analiza sieciowa interakcji MTX i SiL z białkami ludzkimi wykazała, że leki te bezpośrednio oddziałują z kluczowymi białkami związanymi z rakiem piersi. MTX bezpośrednio oddziałuje z ABCG2, DHFR, PCNA, Rb1, SLC19A1, SLC22A6, Tp53, TYMS, podczas gdy SiL wchodzi w interakcje z ABCG2, ATM, CCND1, CDK2, CDK4, CDKN1A, CDKN1B, CYP3A4, MMP9, PCNA, Tp53. Trzy białka (ABCG2, PCNA, Tp53) są wspólne dla bezpośrednich interakcji MTX i SiL.

Białka Tp53_[26], BCL2_[24], PCNA_[22], CCND1_[21], CDK2_[21], CDK4_[21], CDKN1A_[21] zidentyfikowano jako węzły centralne (hub nodes) w sieci interakcji MTX|SiL-PPI, gdzie liczba w nawiasach kwadratowych wskazuje na stopień (liczbę krawędzi lub interakcji połączonych z każdym węzłem). Ponadto, PCNA_[4], CDK2_[4], BECN1_[4], Tp53_[3], BCL2_[3], BCL2L1_[3] zidentyfikowano jako węzły butelkowe (bottleneck nodes), które łączą moduły w sieci.

Analiza ontologii genowej wykazała, że większość bezpośrednich lub pośrednich sąsiadów MTX i SiL znajduje się wewnątrz komórki (wewnątrzkomórkowo), a szczególnie w jądrze komórkowym (28%). Analiza wzbogacenia ścieżek sygnałowych przy użyciu bazy danych KEGG ujawniła, że białka w sieci są zaangażowane w szlaki związane z rakiem, cyklem komórkowym, mikroRNA w raku, karcynogenezą wirusową i inne. Zidentyfikowano grupę białek (BRCA1, CCND1, CDK4, CDK6, CDKN1A, Rb1 i Tp53), które pełnią kluczową rolę w raku piersi, z istotnym udziałem we wszystkich czterech podtypach tego nowotworu (Luminal A, Luminal B, HER2-pozytywny, Basal-like/potrójnie negatywny).

Wśród tych białek, Tp53 wyłania się jako najbardziej kluczowe białko w sieci, będąc węzłem centralnym i butelkowym, wspólnym bezpośrednim sąsiadem MTX i SiL oraz kluczowym graczem w czterech podtypach raka piersi. Tp53, kluczowe białko supresorowe nowotworów, odgrywa centralną rolę w utrzymaniu stabilności genomu i zapobieganiu rozwojowi raka. Według wcześniejszych badań, Tp53 występuje w zwiększonych ilościach w różnych transformowanych komórkach i często ulega mutacji lub inaktywacji w około 60% nowotworów.

Czy niosomalna terapia łącznie z MTX i SiL otwiera nowe perspektywy w leczeniu raka piersi?

Badanie to dostarcza przekonujących dowodów na potencjał NiO@MTXSiL jako skutecznej terapii kombinowanej w leczeniu raka piersi. Formulacja niosomalna wykazała zwiększony synergizm, zmniejszoną toksyczność i silne odpowiedzi przeciwnowotworowe, co sugeruje jej potencjał w opracowaniu bardziej skutecznych strategii leczenia. Zdolność niosomów do jednoczesnej enkapsulacji zarówno SiL (lek hydrofobowy), jak i MTX (lek hydrofilowy) okazała się korzystna w zwalczaniu raka i problemów związanych z nawrotami.

Wyniki wskazują, że NiO@MTXSiL ma wyższą cytotoksyczność wobec komórek raka piersi MDA-MB-231 w porównaniu do wolnych leków, co czyni go obiecującym kandydatem w leczeniu raka piersi. Ponadto, integracja podejść obliczeniowych i eksperymentalnych ujawniła, że podwójne dostarczanie MTX i SiL może celować w Tp53, kluczowe białko w sieci raka piersi. Zgodność między wynikami obliczeniowymi a zwalidowanymi wynikami eksperymentalnymi podkreśla solidność i wiarygodność podejścia in silico, wzmacniając zasadność spostrzeżeń uzyskanych dzięki tej analizie.

Niemniej jednak, wyniki te stanowią podstawę do opracowania nowych podejść opartych na nanomedycynie w leczeniu raka piersi i innych agresywnych nowotworów. Konieczne są jednak dalsze badania in vivo i próby kliniczne, aby w pełni ocenić bezpieczeństwo i skuteczność tej terapii kombinowanej przed jej przeniesieniem do praktyki klinicznej.

Podsumowanie

Badania eksperymentalne wykazały wysoką skuteczność niosomalnego systemu dostarczania leków zawierającego metotreksat i silibinę w leczeniu potrójnie negatywnego raka piersi. Przygotowane nanocząstki charakteryzowały się średnicą około 87 nm, stabilnością fizyczną oraz wysoką efektywnością enkapsulacji obu substancji aktywnych. System wykazywał zwiększone uwalnianie leków w środowisku kwaśnym charakterystycznym dla guza. W testach na komórkach MDA-MB-231 formulacja NiO@MTXSiL znacząco redukowała żywotność komórek nowotworowych, wykazując silny efekt synergistyczny. Zaobserwowano niemal całkowitą eliminację mikroguzów TNBC po 72 godzinach terapii oraz znaczącą indukcję apoptozy. Analiza molekularna ujawniła, że kombinacja MTX i SiL oddziałuje z kluczowymi białkami związanymi z rakiem piersi, szczególnie z białkiem Tp53. Wyniki wskazują na duży potencjał terapeutyczny tej formulacji, choć konieczne są dalsze badania in vivo i próby kliniczne.