Metotreksat hamuje szlak Toll/NF-κB – nowy mechanizm działania

Czy metotreksat może działać poza mechanizmem antyfolatowym?

Metotreksat (MTX) od dziesięcioleci stanowi fundament chemioterapii onkologicznej, głównie dzięki blokowaniu syntezy DNA poprzez hamowanie reduktazy dihydrofolianowej (DHFR). Jednak coraz więcej danych wskazuje, że MTX wywiera również działanie immunomodulacyjne, niezależne od klasycznego mechanizmu antymetabolicznego. Badacze z Journal of Cell Science wykorzystali model Drosophila melanogaster do zbadania wpływu MTX na nadaktywny szlak Toll/NF-κB – kluczowy element odpowiedzi zapalnej i regulacji hematopoezy.

Szlak Toll/NF-κB u muszki owocowej jest wysoce konserwowany ewolucyjnie i stanowi analogię do ludzkiego szlaku receptorów Toll-podobnych (TLR). Jego nadaktywność prowadzi do przewlekłego zapalenia, niekontrolowanej proliferacji komórek krwi oraz tworzenia pseudoguzkowych mas – fenotypu przypominającego procesy obserwowane w nowotworach hematologicznych. W prezentowanych badaniach wykorzystano mutanty genetyczne z konstytutywną aktywacją szlaku Toll (Ubc9−/−, nadekspresja SPE, mutacja Toll^10b) oraz model ostrej odpowiedzi zapalnej indukowanej przez pasożytniczą osę Leptopilina boulardi-17 (Lb-17).

Kluczowe pytanie badawcze brzmiało: czy MTX może hamować nadaktywność szlaku Toll i przywracać homeostazę immunologiczną w modelach przewlekłego zapalenia? Autorzy wykazali, że MTX skutecznie obniża jądrową translokację czynnika transkrypcyjnego Dorsal (homolog NF-κB), zmniejsza penetrację pseudoguzkową oraz normalizuje ekspresję kluczowych genów szlaku Toll, takich jak SPE, Drosomycin i Cactus.

Jakie modele genetyczne wykorzystano w badaniach?

Badania przeprowadzono na trzech głównych modelach genetycznych Drosophila z nadaktywnością szlaku Toll. Pierwszy model stanowiły mutanty Ubc9−/− – larwy z utratą funkcji genu Ubc9 (kodującego koniugat E2 szlaku SUMOylacji), co prowadzi do konstytutywnej aktywacji Toll i 100% penetracji pseudoguzkowej. Drugi model opierał się na nadekspresji SPE (Spätzle-Processing Enzyme, pozytywny regulator szlaku Toll) za pomocą systemu UAS-GAL4 z użyciem promotorów Hemese-Gal4 (ekspresja w komórkach krwi) oraz Collagen-Gal4 (ekspresja w komórkach krwi i ciele tłuszczowym). Trzeci model wykorzystywał mutację Toll^10b – punktową mutację aktywującą w domenie cytoplazmatycznej receptora Toll.

Dodatkowo zbadano model ostrej odpowiedzi zapalnej – dzikie larwy y w infekowane osą pasożytniczą Lb-17, co indukuje aktywację szlaku Toll niezbędną do enkapsulacji jaja osy. Wszystkie modele poddano dwukrotnemu leczeniu MTX (w stadium pierwszej i wczesnej trzeciej larwy), po czym analizowano fenotypy hematopoetyczne, lokalizację czynników transkrypcyjnych, ekspresję genów oraz parametry metaboliczne ciała tłuszczowego.

Metody analityczne obejmowały: immunofluorescencję (przeciwciała anty-Dorsal, anty-Cactus, anty-PH3, anty-L1) z mikroskopią konfokalną LSM710, qRT-PCR dla oceny ekspresji mRNA kluczowych genów (regulatory cyklu komórkowego, komponenty szlaku Toll i insulinowego), barwienie Oil Red O do wizualizacji triglicerydów w adipocytach oraz analizę fenotypową penetracji i ekspresywności pseudoguzkowej. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w co najmniej 3 powtórzeniach biologicznych z n≥10–50 larw na grupę.

Jak MTX wpływa na tworzenie pseudoguzkowych mas?

W mutantach Ubc9−/−, które spontanicznie rozwijają melanotyczne pseudoguzki z 100% penetracją, leczenie MTX zredukowało ten parametr do 35,55%. Podobne efekty zaobserwowano w modelach z nadekspresją SPE – u larw He>SPE-Act penetracja spadła do 43,21%, a u Cg>SPE-Act do 52,81%. Ekspresywność (średnia liczba pseudoguzkowych mas na larwę) u mutantów Ubc9−/− zmniejszyła się z 3,59 do 2,95 po leczeniu MTX.

Immunofluorescencja wykazała, że MTX znacząco obniża jądrową translokację czynnika Dorsal – u komórek ciała tłuszczowego mutantów Ubc9−/− odsetek komórek z jądrowym Dorsal spadł z 93,85% do 15,53%, a w hemocytach z 66,69% do 35,34%. W modelu ostrego zapalenia (infekcja Lb-17) MTX również hamował jądrową lokalizację Dorsal i zmniejszał zdolność enkapsulacji z 68,06% do 43,10%, co wskazuje na immunosupresyjne działanie leku.

Analiza qRT-PCR potwierdziła zmiany na poziomie transkryptomu. W mutantach Ubc9−/− ekspresja SPE była 9,98-krotnie wyższa niż u heterozygot kontrolnych, a po MTX obniżyła się do poziomu 0,83-krotnego. Podobnie, Drosomycin (docelowy gen szlaku Toll) wykazywał 15,29-krotny wzrost u mutantów, który po MTX normalizował się do 1,04-krotnego poziomu kontrolnego. Jednocześnie ekspresja Cactus (negatywny regulator, homolog IκB) wzrosła 20,8-krotnie po MTX, co sugeruje mechanizm kompensacyjny stabilizujący kompleks Dorsal-Cactus w cytoplazmie.

W jaki sposób MTX reguluje proliferację komórek krwi?

Nadaktywność szlaku Toll u badanych mutantów prowadzi do niekontrolowanej proliferacji hemocytów, szczególnie lamellocytów – wyspecjalizowanych komórek immunologicznych zaangażowanych w enkapsulację patogenów. Barwienie fosfo-histonu H3 (PH3), markera mitotycznie aktywnych komórek, wykazało, że w mutantach Ubc9−/− odsetek PH3-pozytywnych komórek był znacznie podwyższony, a MTX skutecznie redukował aktywność mitotyczną.

Na poziomie molekularnym MTX normalizował ekspresję regulatorów cyklu komórkowego. W mutantach Ubc9−/− Cyclin A był nadekspresjonowany 7,83-krotnie, a po MTX ekspresja spadła do 4,12-krotnego poziomu kontrolnego. Podobne zmiany zaobserwowano dla Cyclin B i Cyclin D. Jednocześnie ekspresja dacapo (homolog p21, inhibitor cyklu komórkowego) była supresjonowana u mutantów (0,79-krotnie), a po MTX wzrosła do 12,39-krotnie powyżej kontroli.

Immunostaining z przeciwciałem anty-L1 (marker lamellocytów) wykazał, że w mutantach Ubc9−/− odsetek lamellocytów wynosił 15,95%, podczas gdy po MTX spadł do 2,27%. Korelowało to z obniżeniem ekspresji msn (marker lamellocytów) z 9,31-krotnego do 1,27-krotnego poziomu kontrolnego. Istotnie, liczba plasmatocytów (głównych fagocytów) nie uległa zmianie, co wskazuje, że MTX selektywnie hamuje różnicowanie lamellocytów bez ogólnej toksyczności hematopoetycznej.

Czy MTX wpływa na metabolizm lipidów i sygnalizację insulinową?

Jednym z niespodziewanych odkryć było wykazanie, że nadaktywność szlaku Toll u mutantów Ubc9−/− prowadzi do zaburzeń metabolicznych w ciele tłuszczowym – homologu ludzkiej wątroby i tkanki tłuszczowej. Barwienie Oil Red O ujawniło, że mutanty gromadzą znacznie większe globule lipidowe w porównaniu do heterozygot kontrolnych. Infiltracja ciała tłuszczowego przez hemocyty była masywna (indeks infiltracji znacząco podwyższony), a MTX redukowała ten fenotyp.

Analiza qRT-PCR wykazała, że u mutantów Ubc9−/− komponenty szlaku insulinowego są nadekspresjonowane: dilp6 (ligand insulinopodobny) wzrósł 4,3-krotnie, dInR (receptor insulinowy) 1,68-krotnie, chico (substrat receptora) 2,41-krotnie oraz Dp110 (komponent PI3K) 1,63-krotnie w porównaniu do heterozygot. Jednocześnie ekspresja dFOXO (czynnik transkrypcyjny regulujący metabolizm) i bmm (lipaza ATGL) była supresjonowana do odpowiednio 0,28-krotnego i 0,58-krotnego poziomu kontrolnego.

Po leczeniu MTX wszystkie te parametry uległy normalizacji – poziomy dilp6, dInR, chico i Dp110 spadły, a dFOXO i bmm wzrosły. Sugeruje to, że MTX nie tylko hamuje szlak Toll, ale również przywraca homeostazę metaboliczną poprzez modulację sygnalizacji insulinowej. Jest to szczególnie istotne w kontekście onkologii, gdzie dysregulacja insuliny wiąże się z otyłością, cukrzycą typu 2 i progresją nowotworów.

“Nasze wyniki sugerują, że zaburzenia w szlaku Toll nasilają patologiczne efekty na sygnalizację insulinową, szczególnie w kontekście przewlekłego zapalenia i niekontrolowanej proliferacji komórkowej” – piszą autorzy badania.

Czy nadekspresja Cactus potwierdza mechanizm działania MTX?

Aby potwierdzić, że efekty MTX są mediowane przez szlak Toll, autorzy przeprowadzili eksperymenty genetycznego ratowania mutantów Ubc9−/− poprzez nadekspresję Cactus (negatywnego regulatora Toll) za pomocą systemu UAS-GAL4. Larwy z genotypem Ubc9−/−, Cg>Cact-RFP wykazywały znaczącą redukcję penetracji pseudoguzkowej o 56,55% oraz normalizację ekspresji genów szlaku Toll – SPE spadł z 6,48-krotnego do 1,14-krotnego, a Drosomycin z 12,55-krotnego do 1,35-krotnego poziomu kontrolnego.

Kluczowo, genetyczne ratowanie również przywracało homeostazę insulinową. Poziomy dilp6, dInR, chico i Dp110 normalizowały się do wartości heterozygot kontrolnych, podobnie jak dFOXO i bmm. Ekspresja Cyclin A i Cyclin B również wracała do normy, co wskazuje na przywrócenie kontroli cyklu komórkowego. Te wyniki są zbieżne z efektami farmakologicznymi MTX, potwierdzając, że lek działa poprzez hamowanie szlaku Toll.

Interesujące jest, że ekspresja Cactus wzrastała po leczeniu MTX mimo że Cactus jest genem docelowym Dorsal. Autorzy sugerują mechanizm kompensacyjny – stabilizację białka Cactus niezależną od transkrypcji, co jest zgodne z danymi z badań na ssakach, gdzie MTX stabilizuje IκBα (homolog Cactus) poprzez hamowanie fosforylacji.

Jakie są potencjalne zastosowania kliniczne tych odkryć?

Badania na modelu Drosophila dostarczają mechanistycznych podstaw do repurposingu MTX w terapii chorób zapalnych i nowotworowych. Szczególnie obiecujące wydają się następujące obszary:

Nowotwory hematologiczne z nadaktywnością NF-κB: Wiele nowotworów krwi charakteryzuje się konstytutywną aktywacją szlaku NF-κB, co prowadzi do oporności na chemioterapię. MTX, działając jako inhibitor tego szlaku niezależnie od mechanizmu antyfolatowego, może przywracać wrażliwość komórek nowotworowych na leczenie.

Przewlekłe stany zapalne: MTX jest już stosowany w reumatologii (np. reumatoidalne zapalenie stawów), ale jego mechanizm działania nie był w pełni wyjaśniony. Wyniki badań sugerują, że efekt przeciwzapalny może wynikać z bezpośredniego hamowania szlaku Toll/NF-κB i stabilizacji inhibitorów IκB.

Zaburzenia metaboliczne związane z zapaleniem: Odkrycie, że MTX normalizuje sygnalizację insulinową w kontekście nadaktywności Toll, otwiera możliwości terapeutyczne w zespole metabolicznym, otyłości i cukrzycy typu 2 – stanach, w których przewlekłe zapalenie odgrywa kluczową rolę patogenetyczną.

Autorzy podkreślają jednak ograniczenia translacyjne – model owadzi, choć ewolucyjnie konserwowany, różni się od fizjologii człowieka. Konieczne są badania przedkliniczne na modelach ssaków oraz prospektywne badania kliniczne oceniające skuteczność MTX w kontekście immunomodulacji, niezależnie od działania antymetabolicznego.

Co nowego wniósł ten eksperyment do wiedzy o metotreksacie?

Badanie wykazało, że metotreksat działa jako inhibitor szlaku Toll/NF-κB w modelu Drosophila melanogaster, redukując penetrację pseudoguzkową, jądrową translokację czynnika Dorsal oraz normalizując ekspresję genów zapalnych i regulatorów cyklu komórkowego. Kluczowym odkryciem jest wykazanie, że MTX stabilizuje Cactus (homolog IκB) i przywraca homeostazę sygnalizacji insulinowej zaburzoną przez przewlekłe zapalenie.

Eksperymenty genetycznego ratowania poprzez nadekspresję Cactus potwierdziły mechanizm działania MTX, a podobieństwo efektów farmakologicznych i genetycznych sugeruje, że lek działa poprzez bezpośrednią modulację szlaku Toll. Te wyniki dostarczają racjonalnych podstaw do repurposingu MTX w leczeniu nowotworów opornych na standardową chemioterapię oraz przewlekłych stanów zapalnych z dysregulacją NF-κB.

Pozostaje pytanie, czy efekty MTX są całkowicie niezależne od mechanizmu antyfolatowego. Przyszłe badania powinny zbadać interakcje między folianem a MTX w kontekście immunomodulacji oraz ocenić potencjał terapii kombinowanych łączących MTX z innymi lekami przeciwzapalnymi. Model Drosophila udowodnił swoją wartość jako platforma do szybkiego testowania mechanizmów działania leków i może przyspieszyć odkrywanie nowych zastosowań dla istniejących farmaceutyków.