Metotreksat a gojenie ran – nowe dowody naukowe w badaniach eksperymentalnych

Czy MTX może opóźniać gojenie ran?

Metotreksat może znacząco opóźniać gojenie ran – nowe dowody w badaniach eksperymentalnych

Metotreksat (MTX) to powszechnie stosowany lek w leczeniu chorób nowotworowych i autoimmunologicznych, który – jak wykazują najnowsze badania – może istotnie zaburzać proces gojenia ran. Naukowcy z Van Yüzüncü Yil University przeprowadzili kompleksową analizę wpływu MTX w różnych dawkach na poszczególne etapy gojenia ran u szczurów, dostarczając cennych informacji dla lekarzy prowadzących terapię tym lekiem.

Gojenie rany to złożony proces obejmujący nakładające się fazy zapalenia, proliferacji i przebudowy tkanek. W fazie zapalnej dochodzi do reakcji naczyniowych prowadzących do koagulacji krwi i hemostazy, a także infiltracji komórek zapalnych, głównie leukocytów. Płytki krwi wydzielają różne czynniki wzrostu, w tym płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i fibroblastyczny czynnik wzrostu (FGF). W fazie proliferacji komórki śródbłonka promują angiogenezę, fibroblasty produkują macierz pozakomórkową (ECM), a keratynocyty odbudowują barierę nabłonkową. W końcowej fazie dojrzewania tkanka ziarnista przekształca się w bliznę, a wytrzymałość tkanki na rozciąganie wzrasta.

Większość leków chemioterapeutycznych hamuje metabolizm komórkowy, szybki podział komórek i angiogenezę. “Leki te wykazują toksyczność wobec normalnych komórek, takich jak keratynocyty i fibroblasty, a tym samym hamują wiele kluczowych ścieżek naprawy ran” – piszą autorzy badania. MTX jako antymetabolit ogranicza syntezę puryn i pirymidyn niezbędnych do syntezy kwasów nukleinowych poprzez hamowanie enzymu reduktazy dihydrofolianowej. Oprócz właściwości przeciwnowotworowych wykazuje również działanie przeciwzapalne, antyproliferacyjne i immunosupresyjne.

Jakie są założenia badań eksperymentalnych?

Czy jednak stosowanie MTX rzeczywiście wpływa na proces gojenia ran? Dotychczasowe dane były ograniczone i często pochodziły z badań przeprowadzonych przed opracowaniem nowoczesnych standardów metodologicznych. Autorzy postanowili więc zbadać wpływ zarówno niskiej, jak i wysokiej dawki MTX na gojenie ran w wymiarze morfometrycznym, biochemicznym, histopatologicznym i immunohistochemicznym.

W badaniu wykorzystano 54 zdrowe szczury Wistar Albino, które podzielono na trzy główne grupy (n=18): grupę kontrolną otrzymującą sól fizjologiczną, grupę otrzymującą niską dawkę MTX (3 mg/kg – naśladującą dawkę stosowaną w reumatoidalnym zapaleniu stawów) oraz grupę otrzymującą wysoką dawkę MTX (30 mg/kg – naśladującą dawkę chemioterapeutyczną). Leki podawano dootrzewnowo w dniach 0 (2 godziny przed utworzeniem ran), 7 i 14. U zwierząt wykonano dwie okrągłe rany pełnej grubości o średnicy 10 mm – jedną do analiz biochemicznych, drugą do badań histopatologicznych i immunohistochemicznych.

Czy MTX osłabia dynamikę gojenia ran?

Wyniki badania wyraźnie pokazały, że MTX w wysokiej dawce prowadzi do istotnej utraty masy ciała, podczas gdy w grupie kontrolnej i niskodawkowej obserwowano przyrost masy. Może to odzwierciedlać bezpośrednią toksyczność żołądkowo-jelitową lub zmniejszone przyjmowanie pokarmu i wody przez zwierzęta otrzymujące wysokie dawki leku.

Jakie były efekty stosowania MTX na proces gojenia ran? Ocena morfometryczna wykazała znaczące opóźnienie w kurczeniu się ran w grupie wysokodawkowej MTX w porównaniu z pozostałymi grupami we wszystkich punktach czasowych (p<0,001). W grupie niskodawkowej istotne opóźnienie zaobserwowano tylko w 14. dniu. W 21. dniu rany w grupie kontrolnej i niskodawkowej były całkowicie zamknięte, podczas gdy w grupie wysokodawkowej zamknięcie wynosiło 97,16%.

Jakie zmiany zachodzą na poziomie biochemicznym i histologicznym?

Analiza biochemiczna wykazała, że poziomy hydroksyproliny (markera kolagenu) w grupie wysokodawkowej MTX były niższe we wszystkich punktach czasowych w porównaniu z pozostałymi grupami. Podobnie poziomy czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) w grupach leczonych MTX były znacząco niższe niż w grupie kontrolnej w 7. dniu (p<0,05). “Obniżenie poziomu hydroksyproliny i VEGF może wyjaśniać opóźnione gojenie ran poprzez hamowanie syntezy kolagenu i angiogenezy” – sugerują badacze.

Badanie histopatologiczne ujawniło, że w 7. dniu we wszystkich grupach występowała ciężka martwica i wysięk w obszarze rany. Jednak w grupie kontrolnej obserwowano ciężkie zapalenie, w grupie niskodawkowej umiarkowane, a w grupie wysokodawkowej łagodniejsze. Angiogeneza była znacząca w grupie kontrolnej i umiarkowana w obu grupach MTX. W 14. dniu w grupie kontrolnej wykryto wysoką regenerację nabłonka, umiarkowaną angiogenezę, znaczną kolagenizację i umiarkowaną keratynizację. W grupach MTX procesy te były opóźnione, szczególnie w grupie wysokodawkowej.

Do oceny histopatologicznej zastosowano czteropunktowy system punktacji, oceniający różne parametry, takie jak obszar martwicy, naciek komórek zapalnych, nabłonkowanie, angiogeneza, keratynizacja i odkładanie kolagenu. W 21. dniu badania w grupie kontrolnej zaobserwowano wysoką regenerację nabłonka, luźną kolagenizację i keratynizację. W grupie niskodawkowej MTX wykryto wysoką regenerację nabłonka, umiarkowaną luźną kolagenizację i keratynizację. Natomiast w grupie wysokodawkowej MTX zaobserwowano umiarkowaną regenerację nabłonka, keratynizację i łagodną luźną kolagenizację. Wyniki histopatologiczne w grupach eksperymentalnych były niższe niż w grupie kontrolnej, a najniższy wynik w grupie wysokodawkowej MTX był statystycznie istotny w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,05) we wszystkich punktach czasowych.

Czy MTX modyfikuje ekspresję kluczowych białek?

Czy MTX wpływa na ekspresję kluczowych białek zaangażowanych w proces gojenia? Badania immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne wykazały, że ekspresja czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-α) była wyższa w grupie kontrolnej i umiarkowana w grupach MTX w 7. dniu. Podczas gdy ekspresja TNF-α zmniejszała się w grupie kontrolnej w 14. i 21. dniu, wzrastała w grupie niskodawkowej. W grupie wysokodawkowej ekspresja TNF-α zmniejszyła się w 14. dniu i wzrosła w 21. dniu.

Ekspresja białka szoku cieplnego 70 (HSP70) była znacząca w grupie kontrolnej w porównaniu z grupami MTX w 7. dniu. W grupie kontrolnej ekspresja HSP70 wykazywała tendencję spadkową od 14. do 21. dnia. Natomiast w grupach MTX ekspresja HSP70 stopniowo wzrastała w tym samym okresie. We wszystkich grupach ekspresja kolagenu stale wzrastała, ale była najniższa w grupie wysokodawkowej MTX.

Jakie mechanizmy hamują gojenie ran przy użyciu MTX?

Jak te wyniki przekładają się na praktykę kliniczną? MTX może hamować gojenie ran poprzez różne mechanizmy. “Opóźnione kurczenie się ran leczonych MTX jest zgodne z wynikami niedawnych badań” – zaznaczają autorzy. “MTX zmniejsza proliferację fibroblastów podczas procesu gojenia ran. W konsekwencji zmniejszona transformacja fibroblastów w miofibroblasty może być jednym z powodów opóźnionego kurczenia się ran”.

MTX wykazuje również działanie przeciwzapalne, hamując aktywację makrofagów, chemotaksję i uwalnianie histaminy z bazofili, co może być związane z redukcją poziomów TNF-α. Jak wykazały badania, MTX hamuje syntezę TNF-α w monocytach, makrofagach i komórkach T, a także aktywację NF-κβ indukowaną przez TNF.

Warto podkreślić, że MTX może również hamować angiogenezę poprzez zmniejszenie aktywności angiopoetyny-1 i zwiększenie aktywności angiopoetyny-2. W badaniu zaobserwowano, że angiogeneza była hamowana równolegle z VEGF u szczurów leczonych MTX we wczesnych stadiach gojenia ran.

Jak MTX wpływa na syntezę kolagenu i funkcję keratynocytów?

Badania wykazały również, że MTX wpływa na syntezę kolagenu, który jest głównym składnikiem macierzy pozakomórkowej produkowanym przez fibroblasty. Kolagen odgrywa kluczową rolę we wszystkich fazach gojenia ran, w tym hemostazy, zapalenia, proliferacji i przebudowy. Hydroksyprolina, biochemiczny marker tkanki kolagenowej, jest pozytywnym wskaźnikiem postępu gojenia. W badaniu zaobserwowano, że MTX dawkozależnie obniżał poziomy hydroksyproliny w ranach i hamował odkładanie kolagenu w łożysku rany. Sugeruje to, że MTX może hamować zarówno proliferację, jak i aktywację fibroblastów odpowiedzialnych za syntezę kolagenu, zmniejszając tym samym syntezę kolagenu i obniżając poziomy hydroksyproliny w tkance rany.

Keratynocyty są niezbędne w procesie gojenia ran. Odpowiadają za szybkie tworzenie nabłonka nad uszkodzoną tkanką, ustanawiając barierę między środowiskiem wewnętrznym a zewnętrznym. Komórki te wykazują wielofunkcyjność, produkując różne czynniki sprzyjające reepitelializacji. Ponadto keratynocyty aktywnie generują mediatory, które nie tylko promują angiogenezę, ale także zwiększają syntezę macierzy tkanki łącznej. Badania wykazały, że MTX wywiera zależny od dawki efekt cytotoksyczny na ludzkie keratynocyty. Śmierć komórek została powiązana z regulacją w górę markerów proapoptotycznych (Bax i Bad). Negatywny wpływ MTX na keratynocyty bezpośrednio wpływa na nabłonkowanie, ponieważ keratynocyty są wykonawcami procesu reepitelializacji ze względu na ich właściwości migracyjne i proliferacyjne.

W przeprowadzonym badaniu zaobserwowano opóźnione nabłonkowanie i keratynizację w ranach leczonych zarówno niską, jak i wysoką dawką MTX w porównaniu z grupą kontrolną. W grupie wysokodawkowej opóźnienie nabłonkowania utrzymywało się nawet w 21. dniu. Keratynocyty należą do najbardziej mitotycznie aktywnych komórek w organizmie, a opóźnienie nabłonkowania w 21. dniu w grupie wysokodawkowej w porównaniu z innymi grupami może wskazywać, że keratynocyty są najbardziej wrażliwymi komórkami w procesie gojenia ran na działania niepożądane MTX.

Jakie konsekwencje kliniczne wynikają z badań MTX?

Podsumowując, badanie wykazało, że terapia MTX, szczególnie w wysokich dawkach, znacząco opóźnia proces gojenia ran. “Sugerujemy, że zależne od dawki niekorzystne działanie MTX na gojenie ran może wynikać z jego działania antyproliferacyjnego, antyfibrotycznego, przeciwzapalnego i antyangiogennego” – konkludują autorzy. “W wyniku badań nad MTX, pooperacyjne stosowanie MTX powinno być starannie oceniane, a lepsze zrozumienie wpływu MTX na gojenie ran doprowadzi do lepszego zrozumienia długoterminowych skutków leczenia MTX”.

Dla lekarzy oznacza to konieczność szczególnej uwagi przy stosowaniu MTX u pacjentów, u których planowane są zabiegi chirurgiczne lub którzy doznali urazów wymagających gojenia ran. Być może w takich przypadkach należy rozważyć czasowe modyfikacje dawkowania lub alternatywne strategie terapeutyczne. Jak często w medycynie, właściwe zrównoważenie korzyści terapeutycznych z potencjalnymi działaniami niepożądanymi pozostaje kluczowym wyzwaniem.

Podsumowanie

Badania przeprowadzone na szczurach Wistar Albino wykazały, że metotreksat (MTX) istotnie wpływa na proces gojenia ran, szczególnie w wysokich dawkach. Analiza obejmowała trzy grupy: kontrolną, otrzymującą niską dawkę MTX (3 mg/kg) oraz wysoką dawkę MTX (30 mg/kg). Wyniki pokazały znaczące opóźnienie w kurczeniu się ran w grupie wysokodawkowej, a także obniżone poziomy hydroksyproliny i VEGF, co skutkowało spowolnieniem syntezy kolagenu i angiogenezy. Badania histopatologiczne ujawniły opóźnioną regenerację nabłonka, keratynizację i kolagenizację w grupach otrzymujących MTX. Lek wpływał również na ekspresję kluczowych białek, w tym TNF-α i HSP70. Mechanizm działania MTX obejmuje hamowanie proliferacji fibroblastów, aktywności makrofagów oraz funkcji keratynocytów. Wyniki badań sugerują konieczność ostrożnego stosowania MTX u pacjentów wymagających gojenia ran lub planowanych zabiegów chirurgicznych.

Bibliografia

Karasu Abdullah, Kuşcu Yağmur, Kayikci Caner, Yildirim Serkan, Kuşcu Oğuzhan and Kiliçlioğlu Metin. Effect of low- and high-dose methotrexate on wound healing in rats. Acta Cirúrgica Brasileira 40(5), 614-620. DOI: https://doi.org/10.1590/acb403225.