LDE-MTX – przełomowa terapia w leczeniu udaru niedokrwiennego mózgu

Jakie wyzwania niesie udar niedokrwienny mózgu?

Udar niedokrwienny mózgu stanowi jedną z głównych manifestacji miażdżycy, obok ostrego zawału mięśnia sercowego, i jest jedną z najczęstszych przyczyn zgonów oraz niepełnosprawności na świecie. W wyniku niedoboru glukozy i tlenu w miejscowej tkance, rdzeń zawałowy jest otoczony obszarem niedokrwiennej penumbry, w której dysfunkcja neuronalna jest wciąż odwracalna. Niestety, martwicze jądro ma tendencję do rozszerzania się na obszar penumbry. W tym kontekście kluczowe znaczenie ma opracowanie środków neuroprotekcyjnych, które mogłyby zapobiec dalszemu uszkodzeniu mózgu i przyczynić się do funkcjonalnego przywrócenia obszaru niedokrwiennej penumbry. Leki, które promują hamowanie szlaków aminokwasów pobudzających, wykazały działanie ochronne na neurony i gleję u zwierząt doświadczalnych. Jednak w kilku badaniach klinicznych z udziałem pacjentów z udarem mózgu nie udowodniono spójnych korzystnych efektów tych leków.

Czy LDE to rewolucyjny nośnik leków?

Maranhão i wsp. opracowali system transportu leków składający się ze sztucznie wytworzonych nanocząstek, nazwanych LDE, które przypominają skład lipidowy lipoprotein niskiej gęstości (LDL), ale bez białkowej części LDL – apolipoproteiny B. Gdy nanocząstki LDE mają kontakt z osoczem, pozyskują apolipoproteinę E, która jest rozpoznawana przez receptory LDL na błonie komórkowej, co umożliwia pobieranie LDE przez komórki podobnie jak natywnego LDL. Dzięki temu leki przenoszone w LDE są dostarczane do cytoplazmy za pośrednictwem endocytarnego szlaku receptora LDL.

LDE wykorzystywano jako skuteczny nośnik do transportu leków chemioterapeutycznych, takich jak paklitaksel, metotreksat (MTX), karmustyna, etopozyd i docetaksel, w różnych modelach eksperymentalnych chorób oraz w badaniach klinicznych dotyczących leczenia guzów litych i nielitych, a także w leczeniu pacjentów z miażdżycową chorobą aorty, chorobą wieńcową i endometriozą. We wszystkich testowanych formulacjach LDE-lek, działanie farmakologiczne przenoszonych leków było silniejsze w porównaniu do konwencjonalnych preparatów komercyjnych, a toksyczność była drastycznie zmniejszona, gdy leki te były związane z LDE.

Jak oceniono skuteczność LDE-MTX w eksperymentalnym modelu udaru?

MTX jest szeroko stosowany jako środek przeciwzapalny, głównie w chorobach reumatycznych. Stwierdzono, że MTX związany z LDE zwiększa pobór leku przez komórki. W badaniach wykazano, że LDE-MTX ma zdolność do znacznego zmniejszania obszaru zmian miażdżycowych u królików karmionych cholesterolem oraz do zmniejszania inwazji błony wewnętrznej tętnic przez makrofagi i komórki mięśni gładkich. Leczenie LDE-MTX było również skuteczne w zmniejszaniu rozmiaru zawału i poprawie funkcji serca u szczurów z ostrym zawałem mięśnia sercowego wywołanym podwiązaniem lewej tętnicy wieńcowej. W przeciwieństwie do tego, efekty komercyjnego, wolnego MTX były niewielkie. Wyniki tych badań skłoniły autorów do sprawdzenia hipotezy, czy leczenie LDE-MTX mogłoby mieć również korzystne efekty w szczurzym modelu ostrego niedokrwiennego zawału mózgu.

W celu zbadania potencjału terapeutycznego LDE-MTX w udarze niedokrwiennym mózgu, przeprowadzono badanie na szczurach z wykorzystaniem modelu niedokrwienia korowego wywołanego mikroiniekcjami Endoteliny-1 (ET-1), potężnego wazokonstryktora, który powoduje znaczne zmniejszenie przepływu krwi. Model udaru ET-1 został wcześniej zwalidowany w kilku badaniach. Dorosłe samce szczurów Wistar (250-300 g) uzyskano z Centralnego Ośrodka Zwierząt Uniwersytetu Federalnego w Para. Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i dyrektywą Komisji Europejskiej 86/609/EWG dotyczącą eksperymentów na zwierzętach, za zgodą Komisji Etycznej ds. Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Federalnego w Para.

W badaniu zastosowano dwa protokoły eksperymentalne. Pierwszy miał na celu ocenę poboru LDE przez mózg, gdzie porównano grupę kontrolną bez niedokrwienia z grupą niedokrwienną. Oba zespoły otrzymały LDE znakowane 3H-cholesterolowym oleinianiem eteru. Dwanaście godzin po wstrzyknięciu znakowanego LDE zwierzęta poddano eutanazji, a tkanki i narządy wycięto do kwantyfikacji radioaktywnego poboru. Drugi protokół miał na celu przetestowanie potencjału farmakologicznego LDE-MTX, gdzie zwierzęta z wywołanym niedokrwieniem mózgu otrzymały albo LDE-MTX (1 mg/kg MTX), albo sam LDE, 4 godziny po indukcji niedokrwienia. Zwierzęta z obu grup poddano eutanazji do analizy 7 dni po leczeniu.

LDE przygotowano w Laboratorium Metabolizmu i Lipidów Instytutu Serca Uniwersytetu Medycznego w São Paulo z mieszaniny lipidowej składającej się z oleinianu cholesterolu, fosfatydylocholiny jaja, triglicerydów, cholesterolu i 60 mg pochodnej MTX, zgodnie z wcześniej opisaną metodą. Emulsyfikację związków uzyskano przez homogenizację wysokociśnieniową przy użyciu homogenizatora Emulsiflex C5 w warunkach apirogennych. Średnia wielkość cząstek LDE-MTX wynosiła 40-60 nm, mierzona metodą dynamicznego rozpraszania światła pod kątem 90°. Preparat LDE sterylizowano przez przepuszczenie przez filtr poliwęglanowy o wielkości porów 0,22 μm i przechowywano w temperaturze 4°C do czasu użycia.

W badaniu poboru tkankowego LDE przez parenchymę mózgu wykorzystano ten sam preparat LDE, z tą różnicą, że lipidy były znakowane [3H]-eterem oleinianu cholesterolu i bez dodatku MTX. Tkanki mózgu i wątroby pobrano od zwierząt z grupy niedokrwiennej i kontrolnej 12 godzin po wstrzyknięciu znakowanego LDE. Próbki tkanek przechowywano w zimnym roztworze soli fizjologicznej przed ekstrakcją lipidów chloroformem/metanolem (2:1 v/v). Po ekstrakcji rozpuszczalnik odparowano w strumieniu N₂ i ponownie zawieszono w 500 mL chloroformu/metanolu (2:1 v/v), a połowę zawiesiny umieszczono oddzielnie w fiolkach z 5 mL roztworu scyntylacyjnego. Poziomy radioaktywności mierzono w analizatorze scyntylacji ciekłej.

Po 7 dniach od urazu zwierzęta zostały głęboko znieczulone mieszaniną chlorowodorku ketaminy (72 mg/kg) i ksylazyny (9 mg/kg). Po braku zarówno odruchu rogówkowego, jak i odruchu wycofania łapy, zwierzęta perfundowano 0,9% roztworem soli fizjologicznej, a następnie 4% paraformaldehydem. Mózgi usunięto i utrwalano przez 24 godziny w tym samym utrwalaczu używanym w perfuzji, a następnie krioprezerwowano w gradientach roztworu zawierającego glicerol i sacharozę. Następnie zatopiono je w Tissue Tek, zamrożono w temperaturze -55°C w komorze kriostatu i cięto na grubość 30 μm. W celu analizy histopatologicznej uzyskano również przekroje czołowe o grubości 50 μm z wykorzystaniem barwienia fioletem krezylowym.

Obszar uszkodzenia oceniano w przekrojach o grubości 50 μm barwionych fioletem krezylowym. Miejsca iniekcji ET-1 rozpoznawano po obecności błękitu kolanylowego, bladości, nacieku zapalnym i martwicy, zgodnie z oczekiwaniami po uszkodzeniu niedokrwiennym. Wszystkie barwione przekroje analizowano przy użyciu mikroskopii świetlnej. Obrazy o wysokiej rozdzielczości z bardziej reprezentatywnych pól uzyskano za pomocą aparatu cyfrowego podłączonego do mikroskopu świetlnego.

Jakie są efekty terapeutyczne LDE-MTX?

Do badania efektów LDE-MTX na neuroinflammację i neuroprotekcję po niedokrwieniu korowym wykorzystano następujące przeciwciała: anty-NeuN jako marker dojrzałych neuronów; anty-Iba1 jako specyficzny marker mikrogleju; anty-ED-1 jako marker aktywowanych makrofagów/mikrogleju; anty-GFAP, klasyczny marker astrocytów. Liczby komórek NeuN+ i okrągłych aktywowanych makrofagów/mikrogleju (komórki Iba1+) liczono przy użyciu kwadratowej siatki o szerokości 0,25 mm w okularze mikroskopu dla wszystkich grup eksperymentalnych. Siatka ta odpowiada powierzchni 0,0625 mm². Analizowano pięć zwierząt na czas przeżycia, trzy przekroje na zwierzę, 3-4 pola na przekrój.

Wyniki wykazały, że pobór LDE przez mózg w grupie niedokrwiennej był pięciokrotnie wyższy niż w grupie kontrolnej, co sugeruje, że przerwanie bariery krew-mózg przez ET-1 ułatwiło wnikanie LDE do uszkodzonej tkanki mózgowej. Odpowiedzi na leczenie LDE-MTX zaobserwowane w badaniu silnie sugerują, że znaczna ilość MTX została dostarczona do tkanki docelowej, aby wywołać efekty farmakologiczne.

Zwierzęta niedokrwienne leczone samym LDE (grupa LDE) wykazywały klasyczne ogniskowe uszkodzenie niedokrwienne, z bladością tkanki i intensywną odpowiedzią zapalną charakteryzującą się obecnością komórek jednojądrzastych w rdzeniu niedokrwiennym. Grupa LDE-MTX wykazała znaczne zniesienie nacieku zapalnego w rdzeniu niedokrwiennym. Obie grupy wykazywały podobne obszary pierwotnego zawału, co sugeruje, że leczenie LDE-MTX nie było skuteczne w zmniejszaniu pierwotnego uszkodzenia zawałowego.

W odniesieniu do aktywacji mikrogleju, rozgałęziony mikroglej przeważał po stronie kontralateralnej. W grupie LDE-alone zaobserwowano intensywną aktywację mikrogleju z przewagą okrągłych komórek mikrogleju o morfologii fagocytarnej w rdzeniu niedokrwiennym. Na obwodzie zmiany można było zaobserwować mikroglej o morfologii ameboidalnej. Leczenie LDE-MTX znacznie zmniejszyło aktywację mikrogleju – zaobserwowano znaczny spadek liczby okrągłych komórek mikrogleju w centrum zmiany, jak również ameboidalnych komórek mikrogleju wokół rdzenia niedokrwiennego. Liczba komórek Iba1+ o okrągłym kształcie w grupie LDE-MTX (6,55 ± 1,28) była znacząco mniejsza w porównaniu do grupy LDE-alone (67,17 ± 4,19), co odpowiada 90,25% redukcji liczby wysoce aktywowanych komórek mikrogleju.

Oceniano również wpływ leczenia LDE-MTX na astrocytozę. Zwierzęta niedokrwienne leczone samym LDE wykazywały brak astrocytów w rdzeniu niedokrwiennym i intensywną astrocytozę na obwodzie zmiany niedokrwiennej. Aktywowane astrocyty były obecne zarówno w istocie szarej, jak i białej, w tym w ciele modzelowatym. Podobny wzorzec astrocytozy stwierdzono u zwierząt leczonych LDE-MTX, co wskazuje, że leczenie nie ma wpływu na astrocytozę. Biorąc pod uwagę dość podobne wzorce reaktywności astrocytów, autorzy nie zliczali liczby astrocytów.

Co istotne, zaobserwowano znaczną ochronę neuronów w obszarze okołozawałowym u zwierząt leczonych LDE-MTX. Mikroiniekcje ET-1 do kory ruchowej szczurów wywołały wyraźne uszkodzenie niedokrwienne z widoczną utratą neuronów w rdzeniu niedokrwiennym. Nie stwierdzono różnicy między obszarami pierwotnego uszkodzenia niedokrwiennego w grupach LDE-MTX i LDE-alone, ale występowało znaczne zachowanie ciał komórkowych NeuN+ w regionie okołozawałowym w grupie LDE-MTX w porównaniu do grupy LDE-alone. Kwantyfikacja ciał komórkowych NeuN+ w regionie okołozawałowym wykazała, że grupa LDE-MTX prezentowała wyższą liczbę ciał neuronalnych na pole (60,28 ± 1,37) w porównaniu do grupy LDE-alone (18,86 ± 0,88), co odpowiada 319% wzrostowi ochrony neuronalnej, sugerując znaczny efekt neuroprotekcyjny LDE-MTX.

Co mówią dalsze badania i ograniczenia?

Przejście przez barierę krew-mózg stanowi główne wyzwanie dla systemów nanocząstek mających na celu dostarczanie leków do mózgu. W tym badaniu wykonalność wykorzystania LDE jako nośnika leku do uszkodzonych tkanek mózgowych wykazano przez stwierdzenie, że nanocząstki są pobierane kilkakrotnie więcej przez mózg zwierząt traktowanych ET-1 niż przez mózg kontroli. To stwierdzenie najprawdopodobniej sugeruje, że przerwanie bariery krew-mózg przez ET-1 ułatwiło wniknięcie LDE do uszkodzonej tkanki mózgowej. Podobnie odpowiedzi na leczenie LDE-MTX zaobserwowane tutaj silnie sugerują, że znaczna ilość MTX została dostarczona do tkanki docelowej, aby wywołać efekty farmakologiczne. Niedawno u pacjentów z łagodnymi i złośliwymi guzami mózgu poddanych operacji wewnątrzczaszkowej, autorzy wykazali, że LDE ma zdolność koncentrowania się w nowotworowych i normalnych tkankach mózgowych po wstrzyknięciu dożylnym.

Ponieważ dobrze ustalono, że nadmierna aktywacja mikrogleju przyczynia się do uszkodzenia wtórnego po ogniskowym niedokrwieniu, w tym badaniu zbadano wpływ leczenia LDE-MTX na aktywację mikrogleju. Faktycznie, wyniki ujawniły LDE-MTX jako potężny inhibitor mikrogleju, powodujący dziesięciokrotne zmniejszenie liczby aktywowanych makrofagów. Co ważniejsze, leczenie LDE-MTX skutkowało wyraźną neuroprotekcją w regionie okołozawałowym, popartą zachowaniem trzykrotniej większej liczby ciał komórkowych NeuN+.

Leczenie LDE-MTX nie wpłynęło na pierwotne uszkodzenie zawałowe wynikające z obkurczenia naczyń przez mikroiniekcje ET-1. Różniło się to od efektów leczenia tą formulacją szczurów z zawałem mięśnia sercowego wywołanym podwiązaniem lewej tętnicy wieńcowej. W tych eksperymentach redukcja obszaru zawałowego rzeczywiście nastąpiła w ciągu 30-dniowego okresu obserwacji. Aby wyjaśnić różnice w wynikach między wspomnianym modelem zawału mięśnia sercowego a modelem zawału mózgu u szczurów, można wskazać, że śmierć komórek i martwica w rdzeniu niedokrwiennym mózgu następują szybko, co sprawia, że region ten jest słabo podatny na działanie środków neuroprotekcyjnych mających na celu przywrócenie uszkodzonej tkanki. W badaniach na zwierzętach leczenie innymi lekami znanymi z działania na udary niedokrwienne, takimi jak indometacyna, PJ34 i minocyklina, nie było skuteczne w zmniejszaniu obszaru zawału. Natomiast wcześniejsze badania wykazały, że leczenie minocykliną było w stanie znacznie zmniejszyć obszar zawału korowego i prążkowia, przy użyciu eksperymentalnego modelu okluzji tętnicy środkowej mózgu u dorosłych szczurów niedokrwiennych. Warto wspomnieć, że w skutecznej terapii trombolitycznej przeprowadzanej u pacjentów, rozmiar zawału pozostaje niezmieniony, jak pokazuje obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI).

Terapie trombolityczne mają na celu uratowanie zagrożonej tkanki mózgowej, określanej jako “tkanka zagrożona” lub niedokrwienna penumbra. Jednak to podejście terapeutyczne nie jest korzystne dla wszystkich pacjentów z udarem niedokrwiennym, a z czasem rdzeń zawałowy rozszerza się na niedokrwienną penumbrę i traci się możliwość terapeutyczną. MRI niezgodności pokazuje, że to rozszerzenie ilustruje znaczną ilość możliwej do uratowania tkanki nerwowej podatnej na neuroprotekcję. Odpowiednikiem tego zjawiska w eksperymentalnych modelach udaru jest progresywna utrata ciał komórkowych NeuN+ w obszarze okołozawałowym. W tym badaniu autorzy wykazali znaczną neuroprotekcję osiągniętą przez LDE-MTX w obszarze okołozawałowym.

Mechanizmy, za pomocą których LDE-MTX może chronić neurony w strefie obwodowej zawału, powinny być zbadane w przyszłych badaniach. Niemniej jednak, wcześniejsze badania dotyczące działania tej formulacji mogą rzucić światło na tę kwestię. MTX jest analogiem kwasu foliowego o działaniu antyproliferacyjnym i immunosupresyjnym, stosowanym w leczeniu nowotworów i w autoimmunologicznych chorobach zapalnych. Efekt przeciwzapalny MTX wydaje się występować poprzez wielokrotne działania, w tym antagonizm kwasu foliowego, hamowanie eikozanoidów, metaloproteinaz, gromadzenie adenozyny i blokadę proliferacji limfocytów z odpowiadającą produkcją czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α), interleukiny (IL)-8 i IL-12, między innymi.

Pobór MTX przez komórki przez receptor folianów jest niewystarczający i jest uważany za główną wadę w farmakologii MTX. W badaniu Moura i wsp. wykazano, że włączenie MTX do LDE spowodowało dziewięćdziesięciokrotny wzrost komórkowego poboru leku, w konsekwencji zastąpienia szlaku endocytarnego receptora LDL mechanizmem poboru folianów. Porównując leczenie LDE-MTX z konwencjonalnym MTX, w modelu króliczym reumatoidalnego zapalenia stawów, wykazano, że LDE-MTX był wyraźnie lepszy w zmniejszaniu liczby komórek zapalnych w płynie maziówkowym i w promowaniu redukcji stanu zapalnego w tkance maziówkowej, prawdopodobnie z powodu masowego wnikania MTX do komórek ułatwionego przez LDE jako nośnik.

U szczurów z zawałem mięśnia sercowego, leczenie LDE-MTX przyniosło wyraźne korzystne efekty w obszarze niezawałowym serca, podczas gdy działanie komercyjnego MTX było praktycznie zerowe. Godne uwagi jest, że LDE-MTX znacząco moduluje reaktywność mikrogleju, ale nie obserwowano wpływu tej formulacji na astrocytozę. Sugeruje to, że efekty neuroprotekcyjne zapewniane przez LDE-MTX nie są związane z modulacją funkcji astrogleju. W klasycznych badaniach i w eksperymentalnych modelach udaru krwotocznego minocyklina również nie wykazała żadnego wpływu na astrocytozę. Jednakże, niedawne badanie sugeruje, że minocyklina zwiększa aktywację astrocytów po fototrombozji w układzie czuciowym dorosłych szczurów, przyczyniając się do neuroprotekcji.

Stosunkowo mała liczba zwierząt użytych w każdej grupie eksperymentalnej (leczonych LDE-MTX i kontrolnych) mogła zawęzić moc statystyczną wyników i może być wskazana jako ograniczenie badania. Wybór siedmiodniowego okresu obserwacji wynika z faktu, że jest to czas, w którym uszkodzenia są maksymalne w zwierzęcych modelach niedokrwienia mózgu. W przyszłych badaniach interesujące byłoby wydłużenie okresu obserwacji, aby uchwycić trwałość wyników leczenia.

Wyniki sugerują, że LDE-MTX jest silnym preparatem przeciwzapalnym w ośrodkowym układzie nerwowym, osiągającym wyraźne zmniejszenie aktywacji mikrogleju. Ponadto, leczenie LDE-MTX miało działanie neuroprotekcyjne, co wykazano przez znaczne zachowanie neuronów w obszarze penumbry, bez wpływu na astrocytozę. Te wyniki z modelu szczura z udarem niedokrwiennym wywołanym przez ET-1 uzasadniają dalsze badania przedkliniczne LDE-MTX. Biorąc pod uwagę niedobór skutecznych metod leczenia udaru niedokrwiennego obecnie, to podejście nanomedyczne oferuje obiecujące nowe narzędzie terapeutyczne.

Podsumowanie

Badania wykazały, że innowacyjny system transportu leków LDE-MTX może być skutecznym narzędziem w leczeniu udaru niedokrwiennego mózgu. System składa się z nanocząstek przypominających lipoproteiny niskiej gęstości, które po połączeniu z metotreksatem (MTX) wykazują zwiększoną skuteczność w dostarczaniu leku do uszkodzonych tkanek mózgowych. W przeprowadzonych eksperymentach na modelach zwierzęcych LDE-MTX znacząco zmniejszył aktywację mikrogleju o 90,25% oraz zapewnił trzykrotnie większą ochronę neuronów w obszarze okołozawałowym w porównaniu do grupy kontrolnej. Co istotne, preparat nie wpłynął na pierwotny obszar zawału, ale skutecznie chronił tkankę w strefie penumbry. Choć system wymaga dalszych badań, szczególnie w zakresie długoterminowych efektów, wyniki wskazują na duży potencjał terapeutyczny w leczeniu udaru niedokrwiennego mózgu, gdzie obecnie brakuje skutecznych metod leczenia.