Elektrochemiczny czujnik do monitorowania leków w chemioterapii

Czy elektrochemiczna platforma może usprawnić monitorowanie leków w chemioterapii?

Folinian wapnia (kalcyt folinowy, leucovoryna) odgrywa kluczową rolę w terapii nowotworowej – zarówno jako lek ratunkowy w leczeniu metotreksatem, jak i wzmacniacz działania 5-fluorouracylu. Metotreksat, inhibitor reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), blokuje syntezę tetrahydrofolianu, co prowadzi do zahamowania podziałów komórkowych. Folinian wapnia, będący bezpośrednim źródłem aktywnej formy folianu, chroni zdrowe komórki przed toksycznością metotreksatu, jednocześnie nie osłabiając jego działania przeciwnowotworowego. Z kolei w połączeniu z 5-fluorouracylem folinian wapnia wzmacnia inhibicję syntazy tymidylanowej, kluczowego enzymu syntezy DNA.

Dotychczasowe metody oznaczania tych leków – chromatografia, elektroforeza kapilarna, spektrofotometria – są czasochłonne, wymagają przygotowania próbek i nie zawsze zapewniają wystarczającą czułość. Metody elektrochemiczne oferują alternatywę: są szybkie, ekonomiczne i mogą działać w czasie rzeczywistym. Jednak standardowe elektrody wykazują ograniczenia: powolny transfer elektronów, niską czułość, podatność na zabrudzenia powierzchni i wysokie napięcia pracy.

Irańscy naukowcy opracowali nową platformę elektrochemiczną opartą na kompozycie UiO-66/CdS osadzonym na drukowanej elektrodzie węglowej (SPCE). UiO-66 to metalorganiczny szkielet (MOF) złożony z jonów cyrkonu i kwasu tereftalowego, charakteryzujący się dużą powierzchnią właściwą, wysoką zdolnością adsorpcyjną i możliwością dostosowania struktury porów. Połączenie go z siarczkiem kadmu (CdS) tworzy nanokompozyt o zwiększonej aktywności katalitycznej i lepszych właściwościach elektrochemicznych.

Jak przygotowano i zbadano kompozyt UiO-66/CdS?

Synteza UiO-66 przebiegała metodą solwotermiczną: mieszaninę chlorku cyrkonu (ZrCl₄), kwasu tereftalowego (TPA) i kwasu octowego (AA) w N,N-dimetyloformamidzie (DMF) poddano sonikacji, a następnie umieszczono w autoklawach teflonowych i ogrzewano w 120°C przez 8 godzin. Otrzymane osady przemyto wodą i etanolem, a następnie wysuszono w próżni.

Kompozyt UiO-66/CdS uzyskano przez rozpuszczenie octanu kadmu w etanolu, dodanie UiO-66 i sonikację przez 30 minut. Następnie podgrzano mieszaninę do 80°C, dodano kroplowo roztwór tioacetamidu (TAA) i kontynuowano ogrzewanie przez kolejne 30 minut. Produkt zebrano przez wirowanie, przemyto wielokrotnie i wysuszono. Analiza XRD potwierdziła strukturę krystaliczną UiO-66, podczas gdy brak wyraźnych pików CdS sugerował jego niskie nasycenie w kompozycie.

Obrazowanie SEM ujawniło morfologię kompozytu UiO-66/CdS, potwierdzając jednorodność struktury. Modyfikację elektrody SPCE wykonano przez naniesienie 4,0 µL zawiesiny kompozytu (1,0 mg/mL) na powierzchnię roboczą i wysuszenie w warunkach otoczenia przez 20 minut.

Jakie warunki zapewniają najlepszą odpowiedź czujnika?

Badania metodą różnicowej woltamperometrii pulsowej (DPV) wykazały, że pH buforu fosforanowego (PBS) ma kluczowy wpływ na odpowiedź czujnika. Przy wzroście pH od 3,0 do 7,0 sygnał folinianu wapnia znacząco wzrastał, osiągając maksimum przy pH 7,0. Dalszy wzrost pH powodował spadek sygnału, dlatego pH 7,0 przyjęto jako optymalne dla wszystkich pomiarów.

Porównanie woltamperometryczne niemodyfikowanej elektrody SPCE i UiO-66/CdS/SPCE w obecności 300,0 µM folinianu wapnia pokazało wyraźne różnice. Dla SPCE obserwowano słaby pik oksydacyjny przy 625 mV z prądem 5,3 µA. Po modyfikacji kompozytem UiO-66/CdS potencjał spadł do 500 mV, a prąd wzrósł prawie trzykrotnie – do 15,6 µA. Przesunięcie potencjału o 125 mV w kierunku ujemnym i trzykrotny wzrost prądu dowodzą, że kompozyt znacząco ułatwia transfer elektronów i obniża nadnapięcie oksydacji.

Badania kinetyczne przy różnych prędkościach skanowania (10–300 mV/s) wykazały liniową zależność prądu piku od pierwiastka kwadratowego prędkości skanowania (ν^1/2), co potwierdza, że proces oksydacji folinianu wapnia jest kontrolowany dyfuzją. Równanie regresji: I_p = 1,8948ν^1/2 – 2,4676 (R² = 0,999).

Jaki jest współczynnik dyfuzji folinianu wapnia?

Chronoamperometryczne pomiary przy potencjale 550 mV w roztworach o różnych stężeniach folinianu wapnia (0,1–0,9 mM) pozwoliły wyznaczyć współczynnik dyfuzji. Wykresy Cottrella (I vs. t^-1/2) dla każdego stężenia wykazały liniową zależność. Nachylenia tych wykresów naniesiono na kolejny wykres w funkcji stężenia, uzyskując prostą o nachyleniu 8,0918 µA·s^1/2·mM^-1.

Na podstawie równania Cottrella (I = nFACD^1/2π^-1/2t^-1/2) obliczono współczynnik dyfuzji folinianu wapnia: D = 5,6×10^-6 cm²/s. Wartość ta jest typowa dla cząsteczek organicznych o średniej masie molekularnej w roztworach wodnych i potwierdza, że transport analitu do powierzchni elektrody odbywa się głównie drogą dyfuzji.

Jaka jest czułość i zakres pomiarowy czujnika?

Metoda DPV (potencjał kroku 0,01 V, amplituda pulsu 0,025 V) umożliwiła ilościowe oznaczenie folinianu wapnia w zakresie stężeń 0,1–300,0 µM. Wzrost stężenia analitu powodował proporcjonalny wzrost prądu piku oksydacyjnego. Krzywa kalibracyjna wykazała doskonałą liniowość w całym badanym zakresie z następującymi parametrami:

• Zakres liniowy: 0,1–300,0 µM
• Czułość: 0,0503 µA/µM
• Granica wykrywalności (LOD): 0,04 µM (S/N = 3,0)
• Współczynnik korelacji: R² > 0,999

Tak niski LOD i szeroki zakres liniowy czynią ten czujnik użytecznym zarówno w analizie próbek farmaceutycznych, jak i biologicznych, gdzie stężenia leków mogą się znacznie różnić. Czułość 0,0503 µA/µM oznacza, że każdy wzrost stężenia o 1 µM generuje wzrost prądu o około 0,05 µA, co jest łatwo mierzalne przy standardowej rozdzielczości potencjostatów.

Czy czujnik pozwala na jednoczesną detekcję trzech leków?

Jednym z najbardziej obiecujących aspektów opracowanego czujnika jest zdolność do jednoczesnego oznaczania folinianu wapnia, metotreksatu i 5-fluorouracylu. Pomiary DPV w buforze PBS pH 7,0 przy jednoczesnym wzroście stężeń wszystkich trzech związków wykazały trzy wyraźnie rozdzielone piki oksydacyjne:

• Folinian wapnia: E_pa = 485 mV
• Metotreksat: E_pa = 665 mV
• 5-fluorouracyl: E_pa = 1030 mV

Różnice potencjałów między pikami (180 mV między folianianem a metotreksatem, 365 mV między metotreksatem a 5-fluorouracylem) są wystarczające do selektywnej detekcji każdego z leków bez wzajemnych interferencji. Dla wszystkich trzech związków uzyskano liniowe krzywe kalibracyjne w zakresie 0,5–300,0 µM z wysokimi współczynnikami korelacji.

„Trzy dobrze rozdzielone piki oksydacyjne dla folinianu wapnia, metotreksatu i 5-fluorouracylu zostały zaobserwowane bez wzajemnych interferencji” – podkreślają autorzy badania.

Ta właściwość ma szczególne znaczenie kliniczne, ponieważ folinian wapnia jest często podawany równocześnie z metotreksatem (jako lek ratunkowy) lub z 5-fluorouracylem (jako wzmacniacz działania). Możliwość jednoczesnego monitorowania stężeń wszystkich trzech leków w jednej próbce znacznie upraszcza kontrolę terapii i może przyczynić się do lepszego dostosowania dawek.

Jak czujnik sprawdza się w analizie próbek iniekcyjnych?

Walidację czujnika przeprowadzono na próbkach iniekcyjnych folinianu wapnia, metotreksatu i 5-fluorouracylu. Najpierw oznaczono stężenia bazowe leków w preparatach, następnie próbki wzbogacono o znane ilości analitów i ponownie zmierzono. Dla każdej próbki wykonano pięć powtórzeń pomiarów DPV.

Wyniki testu odzysku były bardzo dobre dla wszystkich trzech leków:

• Odzysk: 96,2–103,3%
• Względne odchylenie standardowe (RSD): < 3,4%

Na przykład, dla próbki iniekcji folinianu wapnia wzbogaconej o 3,0 µM analitu, zmierzone stężenie wyniosło 6,8 µM (przy stężeniu bazowym 3,9 µM), co daje odzysk 98,6% i RSD 2,6%. Podobnie dobre wyniki uzyskano dla metotreksatu (odzysk 96,9–102,2%, RSD 1,7–3,4%) i 5-fluorouracylu (odzysk 98,2–102,3%, RSD 1,7–3,4%).

Wartości odzysku mieszczące się w przedziale 96–104% są uznawane za doskonałe w chemii analitycznej i potwierdzają brak istotnych efektów matrycowych oraz wysoką dokładność metody. RSD poniżej 3,4% świadczy o dobrej powtarzalności pomiarów, co jest kluczowe dla rutynowych analiz klinicznych.

Dlaczego kompozyt UiO-66/CdS poprawia właściwości elektrody?

Wyjątkowe właściwości elektrochemiczne kompozytu UiO-66/CdS wynikają z synergii między metalorganicznym szkieletem a nanokryształami siarczku kadmu. UiO-66 charakteryzuje się uporządkowaną, krystaliczną strukturą z dużą powierzchnią właściwą (typowo 1000–1500 m²/g), co zwiększa liczbę aktywnych miejsc katalitycznych i ułatwia adsorpcję analitów.

Pory UiO-66 (średnica około 6–8 Å) są wystarczająco duże, aby umożliwić dyfuzję cząsteczek folinianu wapnia, metotreksatu i 5-fluorouracylu do wnętrza struktury, gdzie mogą oddziaływać z centrami metalicznymi (Zr⁴⁺) i grupami funkcyjnymi ligandów organicznych. Te oddziaływania – głównie przez wiązania koordynacyjne i oddziaływania π-π między pierścieniami aromatycznymi – stabilizują zaadsorbowane cząsteczki i orientują je w sposób sprzyjający transferowi elektronów.

Siarczek kadmu (CdS) działa jako półprzewodnik o wąskiej przerwie energetycznej (około 2,4 eV), co ułatwia transfer elektronów między analitem a powierzchnią elektrody. Nanokryształy CdS osadzone na powierzchni UiO-66 tworzą heterozłącza, które przyspieszają kinetykę reakcji elektrochemicznych i obniżają nadnapięcie procesów redoks.

Połączenie tych dwóch składników prowadzi do:

• Zwiększenia powierzchni aktywnej elektrody
• Przyspieszenia transferu elektronów
• Obniżenia nadnapięcia oksydacji
• Poprawy selektywności przez kontrolowane oddziaływania z analitami
• Zwiększenia stabilności mechanicznej i chemicznej elektrody

Jakie są implikacje dla praktyki onkologicznej?

Opracowany czujnik elektrochemiczny może znacząco usprawnić monitorowanie terapii onkologicznych z zastosowaniem metotreksatu i 5-fluorouracylu. Dotychczasowe metody chromatograficzne, choć dokładne, wymagają kosztownej aparatury, wykwalifikowanego personelu i czasu (typowo 20–40 minut na pojedynczą analizę). Elektrochemiczna platforma UiO-66/CdS/SPCE oferuje alternatywę: pomiar trwa kilka minut, nie wymaga przygotowania próbek, a koszt analizy jest nieporównywalnie niższy.

Szczególnie wartościowa jest możliwość jednoczesnego oznaczania folinianu wapnia i metotreksatu. W terapii ratunkowej metotreksatem kluczowe jest szybkie podanie folinianu wapnia w odpowiedniej dawce po zakończeniu infuzji chemioterapeutyku. Zbyt wczesne podanie folinianu może osłabić działanie przeciwnowotworowe metotreksatu, zbyt późne – zwiększyć ryzyko toksyczności. Monitoring w czasie rzeczywistym pozwoliłby na precyzyjne dostosowanie momentu i dawki folinianu.

Podobnie, w protokołach łączących 5-fluorouracyl z folianianem wapnia (np. schemat FOLFOX w raku jelita grubego), optymalizacja stosunku stężeń obu leków może poprawić skuteczność terapii przy jednoczesnym zmniejszeniu działań niepożądanych. Czujnik elektrochemiczny mógłby umożliwić personalizację dawkowania w oparciu o indywidualne parametry farmakokinetyczne pacjenta.

Wykorzystanie jednorazowych elektrod drukowanych (SPCE) eliminuje problem zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami i zapewnia wysoką powtarzalność pomiarów. Miniaturyzacja układu pomiarowego otwiera perspektywę rozwoju przenośnych analizatorów typu point-of-care, które mogłyby być używane bezpośrednio na oddziałach onkologicznych lub w poradniach ambulatoryjnych.

Jakie są ograniczenia i wyzwania do dalszych badań?

Pomimo obiecujących wyników, opracowana metoda wymaga dalszej walidacji przed wdrożeniem do praktyki klinicznej. Kluczowym wyzwaniem jest standaryzacja procedury modyfikacji elektrod – precyzyjne naniesienie zawiesiny kompozytu UiO-66/CdS ma kluczowy wpływ na powtarzalność wyników między różnymi partiami elektrod.

Badania przeprowadzono na próbkach iniekcyjnych, które mają stosunkowo prostą matrycę. Próbki biologiczne (surowica, osocze, mocz) zawierają liczne substancje potencjalnie interferujące – białka, metabolity, sole nieorganiczne. Konieczna jest walidacja metody w obecności tych interferentów oraz opracowanie ewentualnych procedur przygotowania próbek, które nie zniwelują głównych zalet metody (szybkość, prostota).

Stabilność modyfikowanych elektrod to kolejny istotny aspekt. Autorzy nie przedstawili danych dotyczących czasu użytkowania elektrod ani ich odporności na wielokrotne użycie. Choć elektrody SPCE są projektowane jako jednorazowe, w praktyce laboratoryjnej często używa się ich wielokrotnie – konieczna jest ocena, jak wiele pomiarów można wykonać na jednej elektrodzie bez utraty czułości.

Badania na większych grupach pacjentów są niezbędne do potwierdzenia korelacji między wynikami uzyskanymi metodą elektrochemiczną a stężeniami terapeutycznymi leków oznaczanymi metodami referencyjnymi (LC-MS/MS). Tylko takie porównanie pozwoli ocenić, czy nowa metoda może zastąpić lub uzupełnić istniejące procedury analityczne w monitorowaniu terapii onkologicznych.

Co nowego wnosi ta platforma elektrochemiczna?

Opracowana przez irańskich badaczy elektrochemiczna platforma UiO-66/CdS/SPCE stanowi znaczący postęp w analityce leków stosowanych w chemioterapii. Czujnik łączy wysoką czułość (LOD 0,04 µM), szeroki zakres liniowy (0,1–300,0 µM) i możliwość jednoczesnego oznaczania trzech kluczowych substancji: folinianu wapnia, metotreksatu i 5-fluorouracylu. Modyfikacja standardowej elektrody drukowanej kompozytem metalorganicznym UiO-66 i siarczkiem kadmu obniża nadnapięcie oksydacji o 125 mV i zwiększa prąd odpowiedzi trzykrotnie, co przekłada się na wyraźną poprawę parametrów analitycznych.

Walidacja na próbkach iniekcyjnych wykazała doskonałe wartości odzysku (96,2–103,3%) i powtarzalność (RSD < 3,4%), potwierdzając praktyczną przydatność metody. Główne zalety – szybkość analizy, prostota obsługi, niski koszt i możliwość miniaturyzacji – czynią tę platformę obiecującym narzędziem do monitorowania terapii onkologicznych w czasie rzeczywistym. Dalsze badania powinny skupić się na walidacji klinicznej, standaryzacji procedur i ocenie stabilności czujników w dłuższym okresie użytkowania.